Los mecanismos enzimáticos individuales se han deducido mediante una diversidad de métodos, que incluyen experimentos cinéticos, estudios estructurales de proteínas y análisis de reacciones con modelos no enzimáticos. Los resultados de esos estudios indican que la extraordinaria capacidad catalítica de las enzimas se debe a propiedades físicas y químicas sencillas, especialmente el enlazamiento y la colocación adecuada de los sustratos en los sitios activos de las enzimas. Se han combinado la química, la física y la bioquímica para esclarecer gran parte del misterio de las enzimas, y la tecnología del ADN recombinante ahora permite probar las teorías propuestas por los químicos de enzimas. Observaciones que sólo hace medio siglo no tenían explicación, ahora se comprenden en su totalidad.
Los mecanismos de muchas enzimas están bien establecidos y dan un cuadro general del funcionamiento de las enzimas como catalizadores. Se comenzará este capítulo con un repaso de los mecanismos químicos sencillos, y se seguirá con una breve descripción de la catálisis. A continuación se examinarán los modos principales de catálisis enzimática catálisis ácido-base y covalente (clasificadas como efectos químicos), así como el enlace con el sustrato.A. Sustituciones nucleofílicas
Muchas reacciones químicas tienen compuestos intermedios iónicos. Hay dos tipos de intermedios iónicos: unas especies son ricas en electrones o nucleofílicas, y otras especies son pobres en electrones, o electrofílicas. Un nucleófilo tiene una carga negativa o un par de electrones no compartido. Suele imaginarse que el nucleófilo ataca al electrófilo, y al mecanismo se le llama ataque nucleofílico, o sustitución nucleofílica. Por ejemplo, la transferencia de un grupo acilo se puede representar con el mecanismo general siguiente:
B. Reacciones de ruptura
También se encuentran reacciones de escisión o ruptura. Los enlaces covalentes se pueden romper de dos maneras: dos electrones permanecen con un átomo, o un electrón puede permanecer con cada átomo enlazado. En la mayor parte de las reacciones, ambos electrones están en un átomo, por lo que se forman un intermedio iónico y un grupo saliente. Por ejemplo, la ruptura de un enlace C—H casi siempre produce dos iones. Si el átomo de carbono retiene ambos electrones, el compuesto que lo contiene se transforma en un carbanión.
Si el átomo de carbono pierde ambos electrones, el compuesto que lo contiene se
transforma en un ion catiónico llamado carbocatión.
En el segundo tipo de ruptura de enlace, menos común, un electrón se queda con cada producto, y se forman dos radicales libres que suelen ser muy inestables. (Un radical libre, o radical simplemente, es una molécula o átomo con un electrón no apareado).
C. Reacciones de oxido-reducción
Las reacciones de oxido-reducción son fundamentales en el suministro de energía biológica. En una reacción de oxido-reducción (o reacción redox), los electrones de una especie se transfieren a otra. Aquí la terminología puede ser bastante confusa, por lo que es importante dominar el significado de las palabras oxidación y reducción, pues aparecerán en forma repetitiva en el resto del libro. Oxidación es la pérdida de electrones: una sustancia que es oxidada tendrá menos electrones cuando se termine la reacción.
La reducción es la ganancia de electrones: una sustancia que gana electrones en una reacción es reducida. Las reacciones de oxidación y reducción siempre suceden en forma simultánea. Un sustrato es oxidado y el otro es reducido. Un agente oxidante es una sustancia que produce una oxidación: toma electrones del sustrato que es oxidado. Así, los agentes oxidantes ganan electrones (es decir, se reducen). Un agente reductor es una sustancia que dona o cede electrones (y en el proceso se oxida).
Las oxidaciones pueden asumir varias formas, como la eliminación de hidrógeno (deshidrogenación), adición de oxígeno o eliminación de electrones. La deshidrogenación es la forma más común de oxidación biológica. Recuerde que las oxidorreductasas (enzimas que catalizan reacciones de oxido-reducción) representan una clase extensa de enzimas, y las deshidrogenasas (enzimas que catalizan la eliminación de hidrógeno) son una de las subclases principales de las oxidorreductasas.
La mayor parte de las deshidrogenaciones suceden por ruptura del enlace C—H, produciendo un ion hidruro (H ). El sustrato es oxidado porque pierde los electrones asociados con el ion hidruro. Esas reacciones se acompañarán por una reducción correspondiente, en la que otro sustrato gana electrones al reaccionar con el ion hidruro. La deshidrogenación del lactato es un ejemplo de la eliminación de hidrógeno. En este caso, la oxidación de lactato está acoplada con la reducción de la coenzima NAD .
Importante
- Oxidación: es la perdida de electrones, una sustancia que se oxida tendrá menos electrones cuando se termine la reacción
- Reducción: es la ganancia de electrones, una sustancia que gane electrones en una reacción es reducida.
Estabilización de estados de transición mediante catalizadores
Para comprender la catálisis es necesario apreciar la importancia de los estados de transición y los compuestos intermedios en las reacciones químicas. La velocidad de reacción química depende de la frecuencia con que chocan las moléculas reaccionantes, de tal forma que se favorezca la reacción. Para que los choques resulten en un producto, las sustancias que colisionen deben tener la orientación correcta, y deben poseer la energía suficiente para acercarse a la configuración física de los átomos y enlaces del producto. El estado de transición es un arreglo inestable de átomos en el que los enlaces químicos están en proceso de formación o de ruptura. Los estados de transición tienen tiempos de vida extremadamente cortos (de unos 10–14 a 10–13 segundos, que es el tiempo de una vibración de enlace). Aunque todavía no se pueden detectar experimentalmente, se pueden pronosticar sus estructuras. La energía que se requiere para llegar al estado de transición a partir del estado basal de los reactivos se llama energía de activación de la reacción, y con frecuencia se le llama barrera de activación.
Los compuestos intermedios, a diferencia de los estados de transición, pueden tener la estabilidad suficiente para poder detectarse o aislarse. Cuando hay un compuesto intermedio en una reacción, el diagrama de energía tiene una depresión que representa la energía libre del intermedio. Esta reacción tiene dos estados de transición, uno anterior a la formación del intermedio y el otro preliminar a su conversión en producto. El paso más lento, que determina la velocidad, es el paso que tiene el estado de transición de mayor energía. Como se requiere una energía relativamente pequeña para que el compuesto intermedio continúe hacia el producto o regrese al reactivo original, el compuesto intermedio es metaestable. Los compuestos intermedios propuestos que son de vida corta para poder aislarlos o detectarlos, con frecuencia se encierra entre corchetes como si fueran estados de transición, a los cuales es probable que se parezcan.
Los catalizadores crean rutas de reacción que tienen menores energías de activación que las de las reacciones no catalizadas. Los catalizadores participan directamente en las reacciones porque estabilizan los estados de transición que hay en las rutas de reacción. Las enzimas son catalizadores que aceleran las reacciones porque disminuyen la energía total de activación. Causan aumento de velocidad al formar una ruta de varios pasos (con uno o varios compuestos intermedios) en el que cada uno de los pasos tiene menor energía de activación que los estados correspondientes en la reacción no enzimática.
Modos de enlazamiento en la catálisis enzimática
A. El efecto de proximidad:
Las altas concentraciones efectivas favorecen la formación mas frecuente de estados de transición Indica que tan favorable están orientados los grupos reactante. La unión de reactivos con la enzima debe ser bastante débil.B. Enlazamiento débil de sustratos con enzimas
Las reacciones de complejos ES son análogas a las reacciones unimoleculares. La posición correcta de los sustratos en un sitio activo produce un gran aumento de la velocidad Sin embargo, las enzimas no alcanzan el aumento máximo de 108 teóricamente alcanzable por el efecto de proximidad.C. Ajuste inducido
La mayor parte de las enzimas parecen catalizadores sólidos porque tienen una flexibilidad limitada, pero las enzimas no son moléculas totalmente rígidas. Los átomos de las proteínas hacen movimientos pequeños y rápidos en forma constante, y hay pequeños ajustes de conformación cuando se unen a ligandos. Una enzima es más efectiva si está al principio en su forma activa, para que no se consuma energía de enlazamiento en convertirla a una conformación activa.D. Estabilización del estado de transición
Durante años se han usado los términos tensión y distorsión para describir la catálisis enzimática. Se sugirió que las enzimas, como catalizadores sólidos, catalizan las reacciones al distorsionar a los sustratos en forma física o electrónica. La estabilización del estado de transición, la interacción aumentada de la enzima con el sustrato en el estado de transición, sólo es una forma más sutil de explicar la tensión. Algunos enzimólogos han estimado que la estabilización del estado de transición explica casi todos los aumentos de velocidad de reacción causados por las enzimas. Si bien es probable que haya varios factores (que ya se describieron) que contribuyan a la catálisis enzimática, hoy se considera que la estabilización del estado de transición es el factor principal la última pieza del rompecabezas de la catálisis.Modos de Acción enzimática
Modos químicos de la catálisis enzimática
La formación de un complejo ES coloca a los reactivos en la cercanía de residuos de aminoácidos del sitio activo de la enzima. Las cadenas laterales ionizables participan en dos clases de catálisis química: catálisis ácido-base y catálisis covalente. Son los dos modos químicos principales de catálisis
A. Residuos polares de aminoácidos en sitios activos
La cavidad del sitio activo en una enzima en general está cubierta con residuos hidrofóbicos de aminoácidos. Sin embargo, también en el sitio activo hay unos pocos residuos polares, ionizables (con algunas moléculas de agua). Los residuos polares de aminoácidos (o a veces coenzimas) tienen cambios químicos durante la catálisis enzimática. Esos residuos forman gran parte del centro catalítico de la enzima.
B. Catálisis ácido-base
En la catálisis ácido-base, la aceleración de una reacción se debe a la transferencia catalítica de un protón. Esta catálisis ácido-base es la forma más común de catálisis en química orgánica, y también es común en las reacciones enzimáticas. Las enzimas que la hacen se basan en cadenas laterales de aminoácido que pueden donar y aceptar protones en las condiciones de pH neutro de las células. Este tipo de catálisis ácido-base, donde intervienen agentes de transferencia de protones, se llama catálisis ácido-base general. (La catálisis por H u OH se llama catálisis ácida específica, o catálisis básica específica). De hecho, los sitios activos de estas enzimas son el equivalente biológico de una solución de ácido o base. Conviene usar B: para representar a una base o aceptador de protón, y BH para representar su ácido conjugado, un donador de protón. (Este par ácido-base también puede escribirse en la forma HA/A ). Un aceptor de protón puede ayudar a las reacciones en dos formas. Puede romper los enlaces O—H, N—H, incluso algunos C—H, quitando a un protón.
C. Catálisis covalente
En la catálisis covalente se une un sustrato en forma covalente a la enzima y se forma un compuesto intermedio reactivo. La cadena lateral que reacciona de la enzima puede ser un nucleófilo o un electrófilo. La catálisis nucleofílica es más común. En el segundo paso de la reacción se transfiere una porción del sustrato del compuesto intermedio a un segundo sustrato. Por ejemplo, el grupo X puede transferirse de la molécula A—X a la molécula B por los dos pasos siguientes mediante el complejo ES covalente X—E:
Al parecer, 20% de las enzimas emplean la catálisis covalente. Para demostrar que un mecanismo enzimático se basa en la catálisis covalente se requiere aislar o detectar el compuesto intermedio, y demostrar que tiene la reactividad suficiente. La observación de la cinética de ping-pong es otro indicador de catálisis covalente.
D. Influencia del pH sobre las velocidades de reacción enzimática
El efecto del pH sobre la velocidad de reacción de una enzima puede indicar cuáles residuos ionizables de aminoácido están en su sitio activo. La sensibilidad al pH suele reflejar una alteración en el estado de ionización de uno o más residuos que participan en la catálisis, aunque a veces se afecta la unión con el sustrato. Con mayor frecuencia, una gráfica de velocidad de reacción contra pH es una curva con forma de campana, siempre que la enzima no se desnaturalice cuando se altere el pH. Un buen ejemplo es el perfil de pH-velocidad para la papaína, una proteasa aislada del fruto de la papaya
La curva acampanada de pH-velocidad se puede explicar suponiendo que la parte ascendente de la curva representa la desprotonación de un residuo de aminoácido en el sitio activo (B), y la parte descendente representa la desprotonación de un segundo residuo de aminoácido en el sitio activo (A). Los dos puntos de inflexión indican en forma aproximada los valores de pKa de los dos residuos ionizables. Una curva en forma de campana simple es el resultado de dos titulaciones traslapadas. La cadena lateral de A (RA) debe protonarse para tener actividad, y la cadena lateral de B (RB) se debe desprotonar.
Cuando el pH es óptimo, a la mitad entre los dos valores de pKa, la mayor cantidad de moléculas de enzima está en la forma activa, con el residuo A protonado. No todas las curvas de pH-velocidad son en forma de campana. Un perfil de pH-velocidad es una curva sigmoidal si sólo participa un residuo ionizable de aminoácido en la catálisis, y puede tener una forma más complicada si participan más de dos grupos. En forma rutinaria, se analizan las enzimas cerca de su valor óptimo de pH, que se mantiene mediante el uso de soluciones amortiguadoras adecuadas.
Reacciones controladas por difusión
Unas pocas enzimas catalizan reacciones a velocidades que se aproximen al límite físico superior de las reacciones en solución. Este límite superior teórico es la velocidad de difusión de los reactivos cercanos uno a otro. Una reacción que se produce con cada choque entre moléculas de reactivos se llama reacción controlada por difusión. Bajo condiciones fisiológicas, se ha calculado que la velocidad controlada por difusiones es de 108 a 109 M–1 s–1. La frecuencia de encuentros puede ser mayor si hay atracción electrostática entre los reactivos.
La unión de un sustrato a una enzima es una reacción rápida. Si el resto de la reacción es sencillo y rápido, el paso de enlazamiento puede ser el paso que determine la velocidad, y la velocidad total de la reacción podrá acercarse al límite superior para la catálisis. Sólo hay pocos tipos de reacciones químicas que pueden avanzar tan rápido. Entre ellas están las reacciones de asociación, algunas transferencias de protones y transferencias de electrones.
Ahora se verán con detalle dos de esas enzimas: triosa fosfato isomerasa y superóxido dismutasa.
A. Triosa fosfato isomerasa:
La triosa fosfato isomerasa cataliza la interconversión rápida de la dihidroxiacetona fosfato (DHAP) y el gliceraldehído 3-fosfato(G3P) en las rutas de la glicólisis y la gluconeogénesis
B. Superóxido dismutasa
La superóxido dismutasa es un catalizador todavía más rápido que la triosa fosfato isomerasa.
La superóxido dismutasa cataliza la eliminación, muy rápida, del radical anión superóxido, •O2 , que es un subproducto del metabolismo oxidante.
La enzima cataliza la conversión de superóxido en oxígeno molecular y peróxido de hidrógeno, el cual se elimina con rapidez por la acción subsecuente de enzimas, como la catalasa.
La reacción catalizada por la superóxido dismutasa se efectúa en dos pasos, durante los
que un átomo de cobre unido a la enzima se reduce y después se oxida.
La reacción total incluye la unión de las moléculas aniónicas de sustrato, la transferencia
de electrones y protones, y la liberación de los productos sin carga —todas son
reacciones muy rápidas con esta enzima.
Lisozima
La lisozima cataliza la hidrólisis de algunos polisacáridos, en especial los que forman las paredes celulares de las bacterias. Es la primera enzima cuya estructura fue resuelta, y por esta razón ha habido un interés duradero en desarrollar su mecanismo preciso de acción.
Muchas secreciones como lágrimas, saliva y moco nasal, contienen actividad de lisozima para ayudar a evitar infecciones bacterianas. (La lisozima causa la lisis o ruptura de las células bacterianas).
Muchas secreciones la contienen:
Lagrimas
-Saliva
-Moco nasal
La lisozima causa la lisis o ruptura de las células bacterianas
El sustrato de lisozima es un polisacárido formado por residuos
alternantes de N-acetilglucosamina (GlcNAc) y ácido N-acetilmurámico
(MurNAc) unidos por enlaces glicosidicos.
Propiedades de las serina proteasas
Las serina proteasas son una clase de enzimas que separan el enlace peptídico de las proteínas. Como lo señala su nombre, se caracterizan por la presencia de un residuo de serina catalítico en sus sitios activos. Las serina proteasas mejor estudiadas son las enzimas relacionadas tripsina, quimotripsina y elastasa. Estas enzimas proporcionan una excelente oportunidad para explorar la relación entre la estructura de la proteína y la función catalítica. Se han estudiado extensamente durante 50 años y constituyen una parte importante de la historia de la bioquímica, y el esclarecimiento de los mecanismos enzimáticos. En esta sección se observará cómo se regula la actividad de las serina proteasas mediante la activación zimógena y se examinará la base estructural en relación con la especificidad del sustrato de diferentes serina proteasas.A. Los zimógenos son los precursores inactivos de las enzimas.
Los mamíferos digieren los alimentos en sus estómagos e intestinos. Durante este proceso, las proteínas alimenticias sufren una serie de reacciones hidrolíticas al pasar por el tracto digestivo. Después de la desintegración mecánica al masticar y mojar con saliva, los alimentos se ingieren y se mezclan con ácido clorhídrico en el estómago. El ácido desnaturaliza a las proteínas, y la pepsina (proteasa que funciona en forma óptima en un medio ácido) cataliza la hidrólisis de las proteínas para formar una mezcla de péptidos. Esta mezcla pasa al intestino, donde se neutraliza con bicarbonato de sodio y se digiere por la acción de varias proteasas, formando aminoácidos y pequeños péptidos que pueden absorberse en el torrente sanguíneo. Las serina proteasas tripsina, quimotripsina y elastasa catalizan gran parte de la digestión de los péptidos en el intestino. Al principio, esas enzimas se sintetizan y almacenan en el páncreas como precursores inactivos llamados zimógenos. Los zimógenos se llaman tripsinógeno, quimotripsinógeno y proelastasa. Es importante guardar estas enzimas hidrolíticas en forma de precursores inactivos dentro de la célula, ya que las proteasas activas matarían a las células pancreáticas rompiendo las proteínas del citoplasma. Cuando los zimógenos son segregados desde el páncreas hacia el intestino delgado, se activan por proteólisis selectiva, mediante la ruptura enzimática de uno o unos pocos enlaces peptídicos específicos. En forma específica, una proteasa llamada enteropeptidasa activa al tripsinógeno y forma la tripsina, catalizando la ruptura de su enlace Lys-6—Ile-7. Una vez activada por eliminación de su hexapéptidoN-terminal, la tripsina rompe de manera proteolítica los demás zimógenos pancreáticos, incluyendo a más moléculas de tripsinógeno (figura 6.21). La formación de tripsina activa por la acción de la enteropepsidasa se puede considerar como el paso maestro de activación.
B. Especificidad de las serina proteasas hacia el sustrato
La quimotripsina, la tripsina y la elastasa son enzimas similares que comparten un ancestro común; en otras palabras, son homólogas. Cada enzima tiene una estructura bilobulada cuyo sitio activo está en una hendidura entre los dos dominios. Las posiciones de las cadenas laterales de los residuos de serina, histidina y aspartato en los sitios activos son casi idénticas en las tres enzimas (figura 6.23). Las especificidades de quimotripsina, tripsina y elastasa hacia los sustratos se han explicado mediante diferencias relativamente pequeñas en sus estructuras. Recuérdese que la tripsina cataliza la hidrólisis de los enlaces peptídicos cuyos grupos carbonilo son de arginina o lisina. Tanto la quimotripsina como la tripsina contienen una hendidura o bolsa de unión que posiciona a los sustratos en forma correcta para el ataque nucleofílico por parte de un residuo de serina en el sitio activo. Cada proteasa tiene una región extendida similar, donde caben los polipéptidos, pero la llamada hendidura o bolsa de especificidad cerca de la serina de sitio activo es muy diferente para cada enzima. La tripsina difiere de la quimotripsina porque en la quimotripsina hay un residuo inalterado de serina en la base de la hendidura hidrofóbica de unión.
C. Catálisis química y por modos de enlazamiento de las serina proteasas
Ahora se examinará el mecanismo de la quimotripsina y las funciones de los tres residuos catalíticos: His-57, Asp-102 y Ser-195. Muchas enzimas catalizan la ruptura de enlaces amida o éster por el mismo proceso, por lo que se puede aplicar el estudio del mecanismo de la quimotripsina a una familia grande de hidrolasas. El residuo Asp-102 está sepultado en un ambiente bastante hidrofóbico. Está unido con un puente de hidrógeno a la His-57, que a su vez está enlazado con un puente de hidrógeno a la Ser-195. Este grupo de residuos de aminoácido se llama tríada catalítica. El ciclo de la reacción comienza cuando la His-57 sustrae un protón de la Ser-195. Así se crea un nucleófilo poderoso (Ser-195) que terminará por atacar al enlace peptídico. Se favorece el inicio de esta parte de la reacción porque la Asp-102 estabiliza la histidina, promoviendo su capacidad para atacar a la serina. El descubrimiento de que la Ser-195 es un residuo catalítico de la quimotripsina fue sorprendente, porque la cadena lateral de serina en general no es suficientemente ácida como para sufrir desprotonación y servir como nucleófilo fuerte.
El grupo hidroximetilo de un residuo de serina tiene, en general, un pKa aproximado de 16, y se parece en reactividad al grupo hidroxilo del etanol. El lector recordará, según la química orgánica, que aunque el etanol se puede ionizar y formar un etóxido, esta reacción requiere la presencia de una base extremadamente fuerte, o el tratamiento con un metal alcalino. Más adelante se verá cómo el sitio activo de la quimotripsina, en presencia de un sustrato, logra esta ionización.
Actividades
1.
a) ¿Qué fuerzas intervienen en el enlazamiento de sustratos y compuestos intermedios a los sitios activos de las enzimas?
b) Explique por qué una unión muy fuerte de un sustrato con una enzima no es lo adecuado para la catálisis enzimática, en tanto que el enlazamiento fuerte del estado de transición sí es deseable.
2. A continuación se ven los diagramas de energía de dos reacciones en varios pasos. ¿Cuál es el paso determinante de la velocidad de cada reacción?
3.Indique cuatro mecanismos principales para la lisozima, y explique cómo se usa cada uno durante la hidrólisis de un enlace glicosídico catalizada por la enzima.
a) ¿Qué fuerzas intervienen en el enlazamiento de sustratos y compuestos intermedios a los sitios activos de las enzimas?
b) Explique por qué una unión muy fuerte de un sustrato con una enzima no es lo adecuado para la catálisis enzimática, en tanto que el enlazamiento fuerte del estado de transición sí es deseable.
2. A continuación se ven los diagramas de energía de dos reacciones en varios pasos. ¿Cuál es el paso determinante de la velocidad de cada reacción?
3.Indique cuatro mecanismos principales para la lisozima, y explique cómo se usa cada uno durante la hidrólisis de un enlace glicosídico catalizada por la enzima.
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